ELISA試劑盒以靈敏度較高、特異性較好的特點在上得到了廣泛的應用,但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大,如不注意,有可能導致顯色不全、花板等結果。我將操作中各個環(huán)節(jié)常出現問題的原因及解決辦法總結于下,以期給同行帶來一些啟發(fā),提高試驗質量。下面分析ELISA試劑盒操作中可能影響結果的原因,并給出相應的解決辦法。
目前用于紡織退漿的淀粉酶主要ELISA試劑盒,淀粉糖化酶(β-淀粉酶),胰淀粉酶,麥芽淀粉酶等。我國主要采用耐熱性強的枯草桿菌淀粉酶即α-淀粉酶(枯草桿菌),β淀粉酶屬于一種細菌淀粉酶是由地衣芽孢桿菌經液體深層發(fā)酵,提取等工序精制而成的淺褐色液體生物制劑,廣泛應用于啤酒等生產中。它對溫度有較強的適應能力。它并非為單一為單一淀粉酶,還含有其它酶組分。后者含量較少,但它們的存在有利于去除織物上的油脂,蛋白質等雜質。
實驗顯示,ELISA試劑盒經過正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,或*沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多,人正常肝細胞這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,人白介素ELISA試劑盒而把血清放在37℃環(huán)境中,又會使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。
ELISA試劑盒于動物(唾液、胰臟等)、植物(麥芽、山萮菜)及微生物。微生物的酶幾乎都是分泌性的。此酶以Ca2+為必需因子并作為穩(wěn)定因子和激活因子,也有部分淀粉酶為非Ca2+依賴型。淀粉酶既作用于直鏈淀粉,亦作用于支鏈淀粉,無差別地隨機切斷糖鏈內部的α-1,4-鏈。因此,其特征是引起底物溶液粘度的急劇下降和碘反應的消失,zui終產物在分解直鏈淀粉時以葡萄糖為主,此外,還有少量麥芽三糖及麥芽糖,其中真菌a-淀粉酶水解淀粉的終產物主要以麥芽糖為主且不含大分子極限糊精,在烘焙業(yè)和麥芽糖制造業(yè)具有廣泛的應用。另一方面在分解支鏈淀粉時,除麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖外,還生成分支部分具有α-1,6-鍵的α-極限糊精(又稱α-糊精)。一般分解限度以葡萄糖為準是35-50%,但在細菌的淀粉酶中,亦有呈現高達70%分解限度的(zui終游離出葡萄糖);
一、選擇試劑
選擇質量優(yōu)良的檢測試劑,嚴格按照試劑說明書進行操作,操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。
二、加樣
大鼠成纖維細胞生長因子ELISA試劑盒可能原因:
1)血清或血漿標本分離不好即進行加樣;
2)手工操作中,加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(特別是室內溫度較高時);
3)加完標本再加酶試劑時酶濺出孔外。
大鼠成纖維細胞生長因子ELISA試劑盒解決辦法:
1) 標本為血清:將血液先自然存放1-2小時后,再用3000rmp離心15分鐘;標本為血漿:必須使用含抗凝劑的血液標本收集管,采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次,放置一段時間后,3000rpm離心15分鐘;若在幾天內檢測,可放在2-8℃冰箱中,若要貯存,則置于-20℃的低溫冰箱內。
2) 加樣后及時放入孵箱。
3) 加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。
4) 如果采用AT或其他全自動加樣,選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。
5) 標本較多時,請分批操作。
常見ELISA試劑盒實驗技術要點,不看就沒了!
我公司技術專員對解析出其實驗技術要點,下面一起來看看吧。
1. 準備好所有實驗額外所需物品,如試管、吸頭、移液器、離心機等;
2. 根據檢測標本數量確定所需試劑的量;
3. 按說明書將所用試劑平衡至室溫,配制所需試劑;
4. 標本制備要規(guī)范,每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備,盡量分裝做備份。短期內無法實驗者,注意低溫保存。
實驗中為了確定*佳信號和*背景應將捕獲抗體(0.5-4μg/ml)和檢測抗體(0.25-2μg/ml)在預實驗中進行彼此相抗的滴定。同時,應包括在適當范圍內的標準品的系列稀釋。按試劑說明書常規(guī)提供的范圍進行操作。
標準品的配制:對于每種細胞因子應仔細閱讀說明書,注意每批的細節(jié)。在使用細胞因子前,瞬時離心試劑瓶,盡可能多地收回其中的細胞因子。根據每批說明書中的細節(jié),將凍干的細胞因子復溶。
一般待測抗原標準曲線的線性范圍的可通過將標準品做8次2倍系列稀釋從2000pg/ml 到15pg/ml。可利用標準的ELISA操作流程、放大試劑盒、第三類試劑、或改變酶底物系統(tǒng)可在一定范圍內提高靈敏度。
為了優(yōu)化靈敏度,建議過夜孵育標準品和標本。若使用過氧化物酶作為顯色系統(tǒng),應嚴禁在洗液和稀釋液中加疊氮鈉,疊氮鈉可抑制過氧化物酶的活性。當測定混合液體中的抗原時,如血清,建議在標本稀釋液中加不相干的Ig。